Eksperyment na głębokim-ultrafioletowym świetle stałym 222 nm-laserze stanowym 3
5.2.4 Wyjście lasera impulsowego o głębokości 222 nm-ultrafioletowego
Rysunek 5.16 Zmiana średniej mocy i szerokości impulsu lasera impulsowego 457 nm z wtryskiwaną mocą pompy przy częstotliwości powtarzania 15 kHz
Lewa oś przedstawia średnią moc lasera 457 nm w mW (200–700), prawa oś przedstawia szerokość impulsu w ns (40–120), a oś pozioma przedstawia wtryskiwaną moc pompy w W (30–42).
Jedna krzywa odpowiada średniej mocy przy f=15 kHz, spadającej z około 650 mW do około 350 mW. Druga krzywa odpowiada szerokości impulsu, rosnącej od około 50 ns do około 110 ns.
Rysunek 5.17 Jakość plamki i wiązki lasera impulsowego 457 nm przy maksymalnej średniej mocy 600 mW i częstotliwości powtarzania 10 kHz (patrz diagram kolorów)
Lewa część to diagram punktowy, a prawa część to diagram jakości wiązki.
Na wykresie jakości wiązki oś pozioma to położenie wzdłuż osi propagacji w mm (0-200), a oś pionowa to średnica plamki w mm (0-4). Istnieją dwie krzywe oznaczone „x poziomo” i „y pionowo”, z My²=1.32 i Mx²=1.15.. Krzywe najpierw maleją, a następnie rosną, przy minimalnej wartości około 100 mm i średnicy plamki około 0,5 mm.
Z wyżej wymienionego eksperymentu z laserem impulsowym 457 nm wynika, że moc lasera impulsowego 457 nm o najwyższej mocy szczytowej uzyskuje się, gdy promień plamki pompy wynosi około 200 μm, L1 i L2 wynoszą około 83 mm i 31 mm, a częstotliwość powtarzania wynosi 10 kHz. Ten laser impulsowy o długości fali 457 nm służy jako źródło światła do generowania lasera pulsacyjnego o długości fali 222 nm poprzez podwojenie częstotliwości za pomocą kryształu BBO. Aby pozycje umieszczenia zwierciadła ogniskującego M3 i kryształu BBO mogły osiągnąć ciągłą moc wyjściową 222 nm, ponieważ jakość wiązki lasera impulsowego 457 nm różni się od tej w przypadku 457 nm, konieczne jest odpowiednie dostosowanie pozycji umieszczenia zwierciadła ogniskującego M3 i kryształu BBO. Zapewnia to, że po przejściu lasera impulsowego o długości fali 457 nm przez zwierciadło skupiające M3, jego długość Rayleigha odpowiada długości kryształu BBO, co poprawia wydajność podwajania częstotliwości. Ostatecznie osiąga się impulsowy laser laserowy o długości fali 222 nm, maksymalnej średniej mocy 35 mW i szerokości impulsu 36 ns (mierzonej poprzez bezpośrednie padanie lasera na detektor). Chociaż do szerszych zastosowań dostępne są opcje komercyjne, takie jak dioda LED UVC 222 nm lub lampa UVC 222 nm, ten system-półprzewodnikowy zapewnia precyzyjny sygnał wyjściowy impulsowy. Rysunek 5.18 przedstawia widmo lasera ultrafioletowego. Średnia moc wyjściowa lasera impulsowego 222 nm wzrasta wraz ze wzrostem mocy wtryskiwanej lasera impulsowego 457 nm, a zależność zmienności pokazano na rysunku 5.19. Rysunek 5.20 przedstawia wykres plamki lasera dla lasera impulsowego o długości fali 222 nm przy najwyższej średniej mocy wyjściowej.
Rysunek 5.18 Widmo lasera ultrafioletowego
Oś pozioma to długość fali w nm (200-260), a oś pionowa to intensywność (0-15000). Szczyt wynosi około 222 nm.
Rysunek 5.19 Zmiana średniej mocy wyjściowej lasera impulsowego 222 nm przy wprowadzonej mocy lasera impulsowego 457 nm przy częstotliwości powtarzania 10 kHz
Oś pozioma to wprowadzona moc lasera 457 nm w mW (200–600), a oś pionowa to średnia moc lasera 222 nm w mW (0–40). Krzywa rośnie liniowo, od około 5 mW do około 35 mW.
Rysunek 5.20 Plamka lasera impulsowego o długości fali 222 nm przy najwyższej średniej mocy wyjściowej (patrz diagram kolorów)
Plamka ma kształt pierścienia o kwadratowym obrysie.
Rysunek 5.21 Stabilność mocy wyjściowej impulsowego lasera 222 nm
Gdy maksymalna średnia moc wyjściowa lasera impulsowego 222 nm wynosi 35 mW, mierzy się stabilność mocy wyjściowej lasera. Jak pokazano na rysunku 5.21, stabilność mocy lasera w ciągu 2 godzin mieści się w granicach 2%.
Oś pozioma to czas w min (0-120), a oś pionowa to średnia moc lasera 222nm w mW (0-50). Krzywa jest w zasadzie stabilna i oscyluje wokół 35 mW.
5.3 Eksperyment z inaktywacją bakterii za pomocą lasera pulsacyjnego o długości fali 222 nm
5.3.1 Zasada i zalety zastosowania światła dalekiego-ultrafioletowego do inaktywacji bakterii
W 1903 roku Niels Finsen otrzymał Nagrodę Nobla za odkrycie, że światło ultrafioletowe może zabijać bakterie. W ciągu następnego stulecia światło ultrafioletowe było szeroko stosowane jako metoda dezynfekcji przedmiotów, oddziałów i innych miejsc publicznych. Podczas trwającej pandemii COVID-19 kraje na całym świecie pilnie potrzebują nowych metod inaktywacji wirusów w powietrzu. Istnieją dwie główne metody fotodynamicznej sterylizacji i dezynfekcji: działanie fotochemiczne i działanie fototermiczne.
(1) Działanie fotochemiczne Kwasy nukleinowe zawierające informację genetyczną (DNA/RNA) bakterii pochłaniają dużą ilość światła ultrafioletowego po napromieniowaniu. Prowadzi to do powstawania w organizmie izomerów diazabenzenów i diazabenzenów, jak pokazano na rysunku 5.22. Substancja ta zaburza funkcje metaboliczne bakterii, uniemożliwiając im rozmnażanie się aż do śmierci. To działanie fotochemiczne jest głównym mechanizmem dezynfekcji tradycyjnego światła ultrafioletowego. Jednakże w przypadku mikroorganizmów pleśniowych i zarodnikowych światło ultrafioletowe ma trudności z przenikaniem przez gęste struktury ścian komórkowych, dlatego DNA nie może absorbować światła ultrafioletowego, co skutkuje stosunkowo niską skutecznością dezynfekcji tych mikroorganizmów.
Rysunek 5.22 Schematyczny diagram dimeryzacji tyminy dwu-niciowego DNA pod wpływem napromieniowania światłem ultrafioletowym (patrz diagram kolorów)
Pokazuje proces-dwuniciowego DNA tworzącego dimery tyminy pod wpływem promieniowania UV.
(2) Działanie fototermiczne Napromieniowanie światłem impulsowym może gwałtownie zwiększyć temperaturę powierzchni komórek, niszcząc ściany komórkowe bakterii, wyparowując płyn komórkowy i całkowicie uszkadzając struktury komórkowe, prowadząc do śmierci. Działanie fototermiczne to wzrost temperatury spowodowany absorpcją energii świetlnej przez substancje. Kiedy mikroorganizmy zostaną napromieniowane z bliskiej odległości intensywnym, pulsującym światłem, pochłaniają dużą ilość energii świetlnej w krótkim czasie, co powoduje gwałtowny wzrost temperatury ich powierzchni i całkowite zniszczenie struktur powierzchniowych, co skutkuje śmiercią. Ponieważ cały proces działania fototermicznego jest bardzo krótki, wewnątrz napromienianego obiektu nie następuje wzrost temperatury, zatem w zasadzie nie ma to wpływu na składniki odżywcze. Zgodnie z fototermicznym mechanizmem dezynfekcji intensywne światło pulsacyjne może skutecznie zabić wszystkie mikroorganizmy. Pulsacyjne światło ultrafioletowe łączy działanie fotochemiczne i fototermiczne w sterylizacji i dezynfekcji, dzięki czemu jego teoretyczna skuteczność dezynfekcji jest wyższa niż w przypadku pojedynczej metody. Tradycyjnym źródłem światła ultrafioletowego do sterylizacji jest lampa rtęciowa. Jednak szczytowa długość fali światła ultrafioletowego emitowanego przez lampy rtęciowe wynosi 254 nm i jest szkodliwa dla ludzkich komórek i tkanek, a w ciężkich przypadkach może powodować raka skóry [4], a także zaćmę. Badania przeprowadzone w ostatniej dekadzie wykazały, że światło ultrafioletowe w paśmie 200-230 nm może inaktywować bakterie, wirusy grypy w powietrzu i patogeny takie jak SARS-CoV-2 bez szkody dla ludzkich komórek. Na arenie międzynarodowej głębokie-światło ultrafioletowe w paśmie 200-230 nm nazywane jest „dalekim-światłem ultrafioletowym”, często realizowanym za pomocą systemów światła dalekiego ultrafioletu 222 nm. W 2022 r. podczas Zimowych Igrzysk Olimpijskich w Pekinie szeroko stosowano dalekie-światło ultrafioletowe do sterylizacji i dezynfekcji, nazywając je „szczepionką lekką”. Dla tych, którzy szukają na sprzedaż światła UV o długości 222 nm, opcje obejmują moduły LED UVC 222 nm lub oprawy lamp UVC 222 nm, które oferują podobne korzyści w świetle dalekiego UV 222 nm w kompaktowych formach. W porównaniu z typowym światłem ultrafioletowym o długości fali 254 nm stosowanym w sterylizacji, biofizyczna zasada mówiąca, że dalekie-światło ultrafioletowe jest nieszkodliwe dla ludzkich komórek, głosi, że białka mają pik absorpcji w tym paśmie. W tym eksperymencie do pomiaru widma absorpcji białka wykorzystano spektrofotometr, jak pokazano na rysunku 5.23. Z rysunku 5.23 widać, że białka charakteryzują się bardzo niską absorpcją światła w typowym paśmie 254 nm, ale stosunkowo wysoką absorpcją w paśmie 200-230 nm. Światło dalekiego ultrafioletu może przechodzić przez mikroorganizmy znacznie mniejsze od komórek ludzkich (typowe średnice bakterii i wirusów to 1 µm i 0,1 µm) [11], natomiast średnica typowych komórek ludzkich waha się od 10 do 25 µm. Światło dalekiego ultrafioletu jest silnie absorbowane przez białka ludzkiej cytoplazmy i gwałtownie tłumione przed dotarciem do jądra komórki ludzkiej [6]. Na przykład najbardziej zewnętrzną warstwą ludzkiej skóry jest warstwa rogowa naskórka, złożona z martwych, pozbawionych jądra keratynocytów. Główną funkcją warstwy rogowej naskórka jest ochrona leżącej pod nią tkanki podskórnej. Większość napromieniowanego światła dalekiego ultrafioletu jest absorbowana przez białka w cytoplazmie warstwy rogowej skóry i nie może przeniknąć przez warstwę rogową skóry, aby dotrzeć do kluczowych komórek podstawnych, czyli melanocytów poniżej, jak pokazano na rysunku 5.24. Dla ludzkich oczu tkanką wrażliwą na światło ultrafioletowe jest soczewka. Jednakże soczewka znajduje się z tyłu rogówki, a rogówka ma grubość około 500 μm. Dlatego przepuszczalność światła dalekiego ultrafioletu przez rogówkę do soczewki wynosi w zasadzie zero.
Rysunek 5.23 Widmo absorpcji białek
Oś pozioma to długość fali w nm (200-300), a oś pionowa to wartość absorpcji (0-3,0). Na krzywej znajdują się trzy punkty: (222, 1,41), (230, 1,25) i (254, 0,168). Wartość absorpcji maleje wraz ze wzrostem długości fali.
Rysunek 5.24 Schematyczny diagram propagacji dalekiego-światła ultrafioletowego w skórze i patogenach
Lewa strona przedstawia strukturę skóry, w której warstwa rogowa naskórka absorbuje dalekie-światło ultrafioletowe. Prawa strona przedstawia powiększony patogen, przez który przenika dalekie-światło ultrafioletowe i działa na bakterie i wirusy.
5.3.2 Eksperyment z inaktywacją bakterii za pomocą lasera pulsacyjnego o długości fali 222 nm
Preparat bakteryjny Escherichia coli jest szeroko rozpowszechniona w przyrodzie i jest kluczowym patogenem dla zdrowia publicznego człowieka, jednym z najbardziej-lekoopornych gatunków z rodziny Enterobacteriaceae i jest często wykorzystywana w badaniach nad dezynfekcją ultrafioletową i higieną środowiska. Bacillus jest blisko spokrewniony z człowiekiem i powoduje zatrucia pokarmowe, a ze względu na odporność na ciepło i kwasoodporność jego zarodników nie można go wyeliminować poprzez pasteryzację ani normalne procedury higieniczne. Dlatego szczepy bakteryjne użyte w tym eksperymencie to Escherichia Coli i Bacillus Cereus. Escherichia coli i Bacillus to odpowiednio Escherichia coli [Escherichia coli CMCC (B) 44102] dostarczone przez Kluczowe Laboratorium Ekologii Wysp Tropikalnych Ministerstwa Edukacji, Hainan Normal University i Bacillus thuringiensis podgatunek kurstaki HD-1 z Laboratorium Badawczego Ekologii Mikrobiologii Środowiskowej Uniwersytetu Hainan Normal. Escherichia coli i Bacillus hoduje się na odżywczym podłożu agarowym, umieszczonym w inkubatorze w temperaturze 35 stopni i 5% CO₂, z okresem hodowli wynoszącym 24 godziny. Odżywcze podłoże agarowe zapewnia firma Guangdong Huankai Microbial Technology Co., Ltd. i jego składniki obejmują pepton, proszek ekstraktu wołowego, chlorek sodu i agar o końcowym pH ≈ 7,3. Hodowane bakterie obserwuje się poprzez przygotowanie szkiełka. Biorąc za przykład Escherichia coli, etapy przygotowania preparatu przedstawiono na Rycinie 5.25, a wyniki obserwacji pokazano na Rycinie 5.26.
Pobieranie slajdów: Preparaty przechowuje się w roztworze alkoholu, wyjmuje i suszy za pomocą dmuchawy gorącego powietrza.
Kropla sterylnej wody: pod super-czystym stołem warsztatowym upuść kroplę sterylnej wody na szkiełko (nie za dużą), aby rozcieńczyć bakterie.
Pobieranie próbek: Użyj płaskiego końca wysterylizowanej wykałaczki, aby delikatnie zanurzyć bakterie z kolonii; wykałaczki nie można użyć ponownie.
Mieszanie: Mieszaj bakterie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby były całkowicie i równomiernie rozmieszczone w kropli wody.
Pieczenie: Wysuszyć potraktowane szkiełko, aby utrwalić bakterie na szkiełku.
Barwienie: Na szkiełko nanieść odczynnik Coomassie Brilliant Blue (toksyczny, operować w rękawiczkach) w taki sposób, aby kropla pokryła płytkę bakteryjną i pozostawić na ponad 15 sekund.
Płukanie: Spłucz nadmiar odczynnika Coomassie Brilliant Blue powolnym przepływem wody, uważając, aby nie przepłukać bezpośrednio płytki bakteryjnej, aby uniknąć jej wypłukania.
Obserwacja: Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu, upuść kroplę olejku na płytkę bakteryjną, a następnie obserwuj przez soczewkę immersyjną.
Rycina 5.25 Etapy przygotowania preparatu bakteryjnego
Obejmuje proces tworzenia obrazu składający się z ośmiu etapów: „pobieranie i suszenie szkiełka”, „kropla sterylnej wody”, „pobieranie próbek”, „mieszanie”, „pieczenie”, „barwienie”, „płukanie” i „obserwacja”.
Rycina 5.26 Obraz Bacillus obserwowany pod mikroskopem
Przedstawia dużą liczbę Bacillus-w kształcie pręcików.
Efekt inaktywacji bakterii Źródłem napromieniowania jest opracowany w tej pracy laser-na ciele stałym-impulsowym w dalekim-ultrafioolecie o długości fali 222 nm, którego szerokość linii widmowej jest mniejsza niż 0,1 nm. Całą operację eksperymentalną przeprowadza się w czystym pomieszczeniu. Narzędzia doświadczalne są sterylizowane przy użyciu sterylizatora-wysokociśnieniowego, a stół warsztatowy jest naświetlany światłem ultrafioletowym przez godzinę przed eksperymentem, aby uniknąć skażenia bakteryjnego ze środowiska. Kuwetę po umieszczeniu zawiesiny bakteryjnej zamyka się szczelnie, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu zawiesiny z powietrzem zewnętrznym. Przez cały czas trwania eksperymentu bakterie znajdują się w płynie odżywczym, aby uniknąć błędów eksperymentalnych spowodowanych naturalną śmiercią. Pobierz 1 ml próbek zawiesin Escherichia coli i Bacillus o określonym stężeniu i umieść je w kuwecie o wysokiej transmisji w-krótkim paśmie ultrafioletu. Włącz laser i dostosowując moc wyjściową lasera oraz pozycję umieszczenia kuwety, natężenie promieniowania lasera 222 nm na kuwecie wynosi 0,1 mW/cm². Użyj lasera 0,1 mW/cm² 222 nm do napromieniania próbek zawiesiny Escherichia coli i Bacillus przy różnych czasach napromieniania. Rysunek 5.27 (a) przedstawia laser o długości fali 222 nm przechodzący pionowo przez zawiesinę Escherichia coli. Próbki kontrolne i próbki napromieniowane hoduje się przez kolejne 24 godziny, a rozmieszczenie bakterii nienapromieniowanych i napromieniowanych pokazano na rysunkach 5.27 (b) i (c). Do określenia liczby bakterii Escherichia coli w grupie kontrolnej i po napromienianiu stosuje się metodę liczenia na płytkach z agarem odżywczym. Aby poprawić dokładność danych eksperymentalnych, każdą próbkę powtarza się 3 razy przy tej samej dawce napromieniania i przyjmuje się wartość średnią.
Rysunek 5.27 222Nm Eksperyment z impulsową sterylizacją laserową
(a) zawiesina Escherichia coli poddana napromienianiu;
(b) Rozmieszczenie Escherichia coli po 0, 10 i 20 sekundach napromieniania, przy czym liczba kolonii na płytce zmniejsza się wraz ze wzrostem czasu napromieniania;
(c) Rozmieszczenie Bacillus po 0, 30 i 60 sekundach napromieniania, przy czym liczba kolonii na płytce zmniejsza się wraz ze wzrostem czasu napromieniania.
Wyniki badań zestawiono w tabeli 5.1. Gdy laser o długości fali 222 nm naświetla zawiesinę Escherichia coli przez 10 s (1 mJ/cm²), stopień inaktywacji wynosi 90,7%; przez 15 s (1,5 mJ/cm²) stopień inaktywacji wynosi 96,9%; a przez 20 s (2 mJ/cm²) współczynnik inaktywacji wynosi aż 100%. Gdy laser o długości fali 222 nm naświetla zawiesinę Bacillus przez 30 s (3 mJ/cm²), stopień inaktywacji wynosi 88,4%; dla 45 s (4,5 mJ/cm²) współczynnik inaktywacji wynosi aż 98,6%; a dla 60 s (6 mJ/cm²) współczynnik inaktywacji wynosi aż 100%. To badanie eksperymentalne pokazuje, że napromienianie laserem impulsowym dalekiego-ultrafioletowego o długości fali 222 nm w dawkach 2 mJ/cm² i 6 mJ/cm² może skutecznie inaktywować odpowiednio Escherichia coli i Bacillus. Z tego doświadczenia i innych doniesień literaturowych wynika, że dawka napromieniania wymagana do inaktywacji Bacillus światłem ultrafioletowym jest większa niż w przypadku Escherichia coli. Powodem jest to, że dawka napromieniowania wymagana do inaktywacji bakterii i wirusów światłem ultrafioletowym zależy głównie od takich czynników, jak wielkość mikroorganizmów, grubość błon komórkowych (ścian) i struktura kwasów nukleinowych (jedno-niciowe lub dwuniciowe-). Ogólnie rzecz biorąc, im większy rozmiar mikroorganizmu i im grubsza błona komórkowa, tym większa jest wymagana dawka napromieniania; mikroorganizmy o strukturze-dwuniciowej mają silniejsze zdolności naprawcze niż te o strukturze-jednoniciowej, dlatego wymagana jest również większa dawka napromieniania. Zarówno Bacillus, jak i Escherichia coli mają strukturę dwuniciową-, ale rozmiar i grubość ścian komórkowych Bacillus wynoszą odpowiednio (1,0 ~ 1,2) nm × (3,0 ~ 5,0) nm i 20 ~ 80 nm, podczas gdy Escherichia coli tylko (0,5 ~ 0,8) nm × (1,0 ~ 3,0) nm i 11 nm. Dlatego dawka promieniowania ultrafioletowego wymagana do inaktywacji Bacillus jest większa niż w przypadku Escherichia coli.
